sábado, 1 de noviembre de 2014

Anfitrión de diversidad genética permite la patogénesis de la fiebre hemorrágica del Ébola y su resistencia



Inserto este interesante artículo científico suscrito por diferentes especialistas que trabajan sobre el virus Ébola, surgido recientemente en países del Africa Central. Muchas dudas quedan flotando en la comunidad internacional sobre el virus mismo. Se hace necesario contar con información científica consistente que permita entender sobre sus características y tratamiento, sobre todo si en definitiva se puede producir vacunas o tratamientos que permitan detener su propagación mundial. Los autores sostienen que este brote es atípico respecto al aparecido en Zaire y las pruebas de la patologia en ratones ha mostrado que exhiben distintos fenotipos de la enfermedad después de la infección del virus, lo cual señala excelentes posibilidades para tratamientos y definitiva curación, aunque la fase de prueba en humanos deberá esperar aún por resultados óptimos. 


Angela L. Rasmussen*,1, Atsushi Okumura*,1,4, Martin T. Ferris2, Richard Green1, Friederike Feldmann3,Sara M. Kelly1, Dana P. Scott3, David Safronetz4, Elaine Haddock4, Rachel LaCasse3, Matthew J. Thomas1,Pavel Sova1, Victoria S. Carter1, Jeffrey M. Weiss1, Darla R. Miller2, Ginger D. Shaw2, Marcus J. Korth1,Mark T. Heise2,5, Ralph S. Baric5, Fernando Pardo Manuel de Villena2, Heinz Feldmann4, Michael G. Katze1, Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.

Tomado de la sección informativa Revista Science. 30 octubre 2014.

Abstrac

Los modelos existentes de ratón de la infección por el virus del Ébola letal no se reproducen los síntomas característicos de la fiebre hemorrágica del Ébola, ni retraso en la coagulación de la sangre y la coagulación intravascular diseminada, ni la muerte de choque, lo cual se restringe estudios de patogénesis a los primates no humanos . Aquí nos muestran que los ratones de la Cruz de Colaboración exhiben distintos fenotipos de la enfermedad después de la infección del virus del Ébola adaptada a ratón. Fenotipos van desde una resistencia completa a la enfermedad letal para la fiebre hemorrágica severa se caracteriza por tiempos de coagulación prolongados y una mortalidad del 100 %. La señalización inflamatoria se asocia con la permeabilidad vascular y la activación endotelial, y la resistencia a la infección letal surgió por la inducción de la diferenciación de linfocitos y la adhesión celular, probablemente mediada por el alelo de susceptibilidad Tek. Estos datos indican que los antecedentes genéticos determina la susceptibilidad a la fiebre hemorrágica del Ébola

Una cepa adaptada a ratón de virus de Ébola (MA- EBOV) no causa síndrome hemorrágico a pesar de causar enfermedad mortal en ratones de laboratorio, y no puede ser utilizado eficazmente para estudiar fiebre hemorrágica del Ébola (EHF) patogénesis, como la disimilitud a la enfermedad humana limita la capacidad para identificar correlatos clave de la patogénesis viral o evaluar con precisión el efecto de las vapcunas o agentes terapéuticos. Estudios de patogénesis de la EHF por lo tanto se han limitado a los macacos (1-4), cobayas (5,6) , y los hámsters sirios (7). Aunque estos modelos recapitulan con precisión la mayoría de las características de la enfermedad de la EHF, preocupaciones prácticas y éticas limitan su uso, incluyendo fondos no reproducibles genéticos, el costo, la disponibilidad de animales, y la disponibilidad de reactivos. Los estudios epidemiológicos de la infección EBOV han identificado una gama de fenotipos patógenos, que no están vinculados a las mutaciones específicas en el genoma viral (8,9) . Esto sugiere que la respuesta del huésped puede determinar la gravedad de la enfermedad después de la infección EBOV.

Para determinar la línea de base fenotípica, desafiamos a los ocho fundadores CC por vía intraperitoneal con MA- EBOV o la cepa Mayinga de tipo salvaje EBOV ( WT- EBOV ). MA- EBOV difiere de la secuencia WT- EBOV publicada por sólo 13 cambios de nucleótidos, tres de los cuales están en silencio (14) . MA- EBOV es patógeno en los conejillos de indias y los macacos (1), y hace que la EHF letal en hámsters sirios (7). A pesar de la observación de 25 a 100 % de mortalidad desafío siguiente MA- EBOV en dosis múltiples (fig. S1), que no encontró ninguna evidencia de enfermedad hemorrágica o la susceptibilidad a la enfermedad después de la infección letal con WT- EBOV . Se evaluó el fenotipo patogénico producida por la infección intraperitoneal con 100 unidades formadoras de focos ( FFU) de MA- 47 disponibles en EBOV líneas CC- RIX (Tabla 1). Observamos fenotipos de la enfermedad que van desde la resistencia completa a la enfermedad letal a grave patología EHF - asociado antes de la muerte , así como las líneas que la infección letal sin síntomas de la EHF, pero a veces con decoloración hepática.

Tabla1. Distribución de los fenotipos a través de líneas de CC- RIX . La negrita indica cruces CC- RIX utilizados en este estudio .
Resultado
Frecuencia
Características
CC-RIX line ID
Mortalidad (%)
de la infeción
de fenotipo (%)
fenotípicas


Resistencia
19 (9/47)
0% mortalidad
15156x1566
0



3252x8042
0



5119x8018
0



3252x8002
0



8034x8048
0



8048x8026
0



8026x5080
0



1566x8043
0



16012x15119
0
Parcialmente
11 (5/47)
>50%
mortalidad
18042x3032
20
resistente


15156x3252
20



477x16912
40



13140x16680
20



16072x15119
20
Letal
17 (8/47)
>50% 
mortalidad
3032x16188
80



8004x8043
60



8002x3032
60



16188x8005
100



8008x8016
100



16441x8024
100



16912x5489
100



3415x16012
100
Letal con
19 (9/47)
>50% mortalidad, decoloración hepática
8042x16513
60
hepatitis


16513x15156
100



16188x3252
75



13067x16912
100



5489x16557
80



16912x16211
60



16211x13140
80



8024x8049
100



8049x8010
100
Letal con EHF
34 (16/47)
>50% mortalidad
coagulopatía grave ( sangre descolorida, prolongada coagulación de la sangre )
3609x5119
60



8018x3154
80



13140x3015
100



8016x8034
100



16441x8005
100



8010x16441
100



3032x16441
60



8005x8002
100



3154x3609
100



3609x5489
100



16557x13067
100



16513x16188
100



15155x8054
100



3393x8052
100



8043x8008
80



8048x15155
80
 
Hemos realizado estudios detallados sobre dos líneas representativas, 13140x3015 (susceptibles a la EHF letal) y 15156x1566 (resistente a la enfermedad letal ). Los ratones de ambas líneas perdieron aproximadamente el 15 % de su peso corporal durante los primeros cinco días después de la infección (pi) (fig. 1A). Sin embargo, los ratones susceptibles sucumbieron a la infección letal en los días 5-6 del pi, mientras que los ratones resistentes sobrevivió y se recuperó completamente de peso corporal el día 14 (Fig . 1B ) . En el día 5 pi, los ratones susceptibles presentó los hallazgos patológicos consistentes con EHF, incluyendo prolongada coagulación de la sangre, hemorragia interna , la sangre de color café, esplenomegalia, y la decoloración hepática y la textura suavizado (Fig. 1C). Los ratones resistentes, sin embargo, no tenían patología macroscópica evidente al momento de máxima pérdida de peso corporal y ninguna alteración en la apariencia del hígado (Fig.1D). Ninguno de los dos ratones susceptibles ni resistentes desarrollaron la enfermedad clínica observable después de la provocación con WT- EBOV. Hemos detectado extremadamente bajos títulos de virus en el día 3 en el hígado y el bazo de los animales después de la infección WT- EBOV, y estos eran 100-1000 veces más bajos que los títulos de órganos detectados en ratones infectados con MA- EBOV (fig. S2). No se detectó el virus en el día 5 en cualquier órgano o cualquier ratón, lo que indica que el WT- EBOV no es capaz de replicarse productivamente en estas cepas de ratón.







Fig. 1. Distinción, morbilidad y mortalidad después de la infección MA- EBOV en líneas de ratones CC- RIX . (A) Porcentaje de comenzar el peso corporal más de curso de la infección en susceptibles (cuadrados rojos) y los ratones resistentes ( círculos azules). Los datos mostrados son la media ± SEM de cinco ratones por línea CC- RIX . (B) Curva de supervivencia de Kaplan- Meier para los susceptibles (rojo ) y resistente ( azul) ratones. Cinco ratones fueron utilizados para cada línea CC- RIX . (C a F) Aspecto macroscópico de hígado en la necropsia en no infectada susceptible ( C) y (D) los ratones resistentes , y en el día 5 post- infección en susceptible ( E) y (F) los ratones resistentes.


En el hígado y bazo de ambas líneas de ratones, se observaron niveles equivalentes de ARN viral (Fig. 2, A y B). Sin embargo, se observó 1-2 Logs de niveles más altos de virus infeccioso en el hígado y el bazo susceptibles en comparación con el hígado y el bazo resistentes después de la titulación del virus por ensayo de formación de foco cuando la producción de virión infeccioso detectable se convirtió en el día 3 (Fig. 2 , C y D) , lo que sugiere que la resistencia puede estar asociada con un defecto en el ensamblaje del virión, la secreción, u otros procesos de post-transcripcionales. Se confirmó este hallazgo tiñendo secciones de hígado de los ratones susceptibles y resistentes en el día 5 pi para VP40, la proteína de la matriz viral. Hemos observado sustancialmente menor tinción VP40 en el hígado resistente (Fig.2, E y F) en comparación con hígado susceptible (Fig. 2, G y H , y la fig. S3). Análisis de secuencias no mostró cambios de nucleótidos entre los genomas de virus, ya sea en línea, lo que indica que estos efectos no pueden atribuirse fácilmente a la selección de cuasi-especies con aptitud viral diferente (Tabla S1). A pesar de las diferencias significativas en los títulos de virus infecciosos entre las dos líneas de ratones, se observó un nivel similar de la inflamación y apoptosis en el bazo y el hígado, aunque las dos líneas muestran distinta histopatología (figs. S4 a S6). A pesar de tropismo de órganos similares, infección por el virus se produjo en diferentes tipos de células hepáticas en las dos líneas de ratón. Ratones susceptibles tenía antígeno viral en esencialmente todos los hepatocitos ( Fig. 2F y tabla S2 ), mientras que el antígeno viral resistente a los ratones fue restringida a las células que carecen de la morfología de los hepatocitos típica, las células endoteliales más probable y células de Kupffer (Fig. 2G), consistente con bajos infección Reston patogenicidad del virus (15). Posiblemente en ratones resistentes, respuestas de las células endoteliales y de los macrófagos hepáticos infectados limitan la producción de virus y controlar la inflamación sistémica y la coagulopatía. La infección hepática generalizada en ratones susceptibles puede explicar la forma en que ambos producen una mayor cantidad de virus infecciosos e inducir vías de la coagulación desregulados.

Fig. 2.Replicación MA- EBOV en líneas de ratones CC- RIX . (A y B) en tiempo real PCR cuantitativa que muestra la expresión de los genomas MA- EBOV relativos a ratón 18S rRNA en el bazo (A) y el hígado (B). Los datos mostrados son la media ± SEM de tres ratones por punto de tiempo por línea RIX . (C y D) Titulación del infecciosa MA- EBOV en homogeneizados de órganos de bazo (C) y el hígado (D) cuantificada como enfoque unidades por mililitro de conformación. Ningún virus infeccioso fue detectado antes del día 3 pi Los datos mostrados son la media ± SEM de dos experimentos utilizando 2-3 ratones por punto de tiempo por línea CC- RIX . (E a H) Tinción inmuno-histoquímica para VP40 en resistente hígado [(E) y (F )] y el hígado susceptible [( G) y (H )] . La flecha indica la morfología de los hepatocitos representante ( prueba t , * P < 0,05 ) .


Hemos cuantificado el grado de coagulopatía por la medición de los tiempos de coagulación de la sangre. En los días 5-6 pi, los ratones susceptibles mostraron prolongación significativamente el tiempo de trombina (TT), tiempo de protrombina (PTT), y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) en comparación con resistente y ratones C57BL / 6J (Fig. 3 , A a C). Un pico inicial en los niveles de fibrinógeno en suero en ratones susceptibles en el día 3 pi fue seguido por una caída precipitada (Fig. 3D) antes de la muerte. Este aumento puede ser debido a la producción de fibrinógeno compensatorios en respuesta a la muerte celular hepática y el agotamiento de factor de coagulación consiguiente, en consonancia con las observaciones de otros modelos de la EHF en la que la hemorragia severa y coagulopatía típicamente picos dentro de las 48 horas anteriores a la muerte (3,7)


Fig. 3: La cuantificación de la coagulopatíay hemorragia en las líneas de ratón CC- RIX . (A a C) Los tiempos de coagulación en segundos para la trombina (A), la protrombina (B), y activado de tromboplastina parcial (C) sobre curso de la infección MA- EBOV . Niveles (D) Suero de fibrinógeno en ratones CC- RIX más de curso de la infección MA- EBOV . Todos los datos que se muestran son la media ± SEM de 2 experimentos incluyendo 2-5 animales por punto de tiempo. ( ANOVA con post-hoc HSD de Tukey. * P <0 0="" font="" p="">



Se investigaron las respuestas de acogida transcripción vinculados al resultado de la enfermedad en las líneas de CC- RIX. Importantes genes expresados ​​diferencialmente con respecto a las muestras infectadas de manera falsa coincidentes en el tiempo (valor de p ajustados - FDR < 0,05 ; cambio veces > 1,5 ) tanto en el bazo y el hígado fueron 10-100 veces mayor número de DEG en ratones susceptibles que los ratones resistentes (Fig . 4 , A y B, y los datos complementarios 2 y 3 ). Estos datos sugieren que EHF se caracteriza por la inducción temprana de una respuesta transcripcional de magnitud mayor. En ratones susceptibles relativos a los ratones resistentes, genes asociados con la infección EBOV fueron inducidos diferencialmente. A principios de la infección en los bazos de ratones susceptibles al día pi 1, se observó enriquecimiento de MAPK p38 y la señalización de ERK, procesos que estimulan la infección productiva EBOV (16 ,17).

Además se observó el aumento de expresión de NFkB y la inducción de procesos proinflamatorios , lo que puede reflejar primeros objetivos de la infección en los órganos linfoides secundarios . Durante el día 3 p.i. tanto en el hígado y el bazo, las vías inflamatorias se enriquecieron cada vez más en ratones susceptibles, como lo hizo vías asociadas con la muerte celular, incluyendo aquellos asociados con la citotoxicidad y apoptosis en los macrófagos y células endoteliales. Ambas líneas resistentes y susceptibles indujeron múltiples vías inmunes en el bazo. Durante el día 5, a pesar de la expresión génica diferencial alcanzó su punto máximo en ambas líneas, los conjuntos de genes implicados eran distintos y probablemente reflejan diferentes cursos de la enfermedad.




Fig. 4. Las respuestas del huésped distintos asociados con fenotipo de la enfermedad. (A y B) Número de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) ya sea hasta reguladas (eje y positivo) o hacia abajo-regulada ( eje y negativo ) con respecto a las muestras con infección simulada coincidentes en el tiempo en el bazo (A) y el hígado (B ).


Se identificaron los genes expresados ​​diferencialmente únicos a ratones susceptibles en el hígado y se observó el enriquecimiento en los genes relacionados con la integridad vascular en los días 3 y 5, incluyendo las tirosina quinasas endoteliales Tie1 y Tek (Tie 2). Expresión Tie1and Tek estaba deprimido en comparación con los niveles en los animales con infección simulada en el día 5, coincidiendo con el inicio de la coagulopatía. Utilizamos el software Ingenio Pathway Análisis (IPA) para generar redes que predicen la actividad molecular (18) , y predijo la activación de los procesos asociados a la diferenciación vascular y la activación endotelial, la inflamación mediada por IL-6, y el sangrado , y la inhibición de vías asociadas con la integridad vascular y la regulación inflamatoria en los hígados sensibles ( fig. S7). TIE1 y TEK señalización promover la activación de factores de coagulación, tales como la trombina (F2), el factor tisular (F3) , y la proteasa receptores 1 , 3 activan , y 4 ( PAR1 / F2R , PAR3 / F2RL2 , PAR4 / F2RL3 ) (19), que se han implicado de manera mecánica en coagulopatías mediadas por EBOV y otros virus (4, 20), y son regulados diferencialmente en estos ratones (Fig. S8). Tie1 y expresión Tek fue elevado consistentemente en los bazos de ratones resistentes, lo que implica que la regulación de señalización endotelial y fuga vascular contribuye a la resistencia a la enfermedad en los ratones susceptibles.

En hígados de ratones resistentes en el día 5, la expresión del gen asociado con la densidad vascular y la angiogénesis aumentó, lo que sugiere que esta línea controla eficazmente la fuga vascular, potencialmente a través de la reparación o el mantenimiento estructural de los vasos sanguíneos. Parece probable que la restricción de la infección MA- EBOV endoteliales y las células de Kupffer en ratones resistentes impide la inducción de moléculas específico de hepatocitos que mejoran la inflamación sistémica, trombocitopenia y coagulopatía.

Se investigaron los genomas y encontró que los alelos Tie1 a través de los ocho fundadores de CC son de las tres subespecies Mus musculus , y son muy divergentes entre sí ( 21 ) , lo que nos impidió identificar relaciones significativas entre alelos Tie1 y fenotipo. Por el contrario, los alelos Tek en el CC- RIX se derivan de sólo dos subespecies: M. m. domesticus y M. M. musculus , y son muy diferentes entre sí. Tek alelos distintos se asociaron previamente con coagulopatías inflamatorios y la disfunción vascular (22-26). En nuestro análisis preliminar, se identificaron relaciones estadísticamente significativas entre los alelos subespecíficas Tek y la aparición inicial de la pérdida de peso ( ANOVA , F2,31 = 5,581 , p = 0,0085 ), los días promedio de muerte ( ANOVA F2,34 = 10.519 , p = 0,00028 ) , y la mortalidad (ANOVA F2,37 = 8,5553 , p = 0,0008 ) (fig. S9).

Aquí, reproducido EHF en un modelo de ratón que permitirá la vinculación de los polimorfismos genéticos específicos a tropismo, la producción de virus infeccioso, las respuestas de tipo específico de células, y el resultado fenotípico. El modelo CC proporciona una plataforma única para mapear alelos de susceptibilidad en el contexto de la patogenia de la EHF, y rápidamente aplicar estos resultados al desarrollo de productos terapéuticos candidatos y vacunas. Actividades de detección en curso en ratones CC- RIX identificarán loci genéticos adicionales que contribuyen a la enfermedad hemorrágica, letalidad, o resistencia a la enfermedad severa.

La frecuencia de diferentes manifestaciones patológicas a través de las líneas 47 CC- RIX examinados hasta ahora son similares en variedad y proporción con el espectro de la enfermedad clínica observada en pacientes con enfermedad del virus Ébola en el brote de 2014 África Occidental, con síntomas hemorrágicos que aparece en el 30-50 % de los pacientes (27, 28) . Aunque no podemos descartar la posibilidad de que los sobrevivientes humanos han inmunidad preexistente a EBOV o un virus relacionado, nuestros datos sugieren que los factores genéticos juegan un papel importante en la determinación de evolución de la enfermedad en individuos no tratados previamente, sin exposición previa o cebado inmunológico.

Si bien todavía no hemos proyectado ratones CC- RIX para la susceptibilidad a otras especies de virus Ébola, anticipamos que íbamos a observar una distribución similar de fenotipos patógenos después de la infección con virus que son capaces de replicarse en ratones. El actual brote de 2014 África Occidental es causada por la misma especie del virus Ébola como la MA- EBOV utilizado en este artículo. También hay similitudes en el espectro de la enfermedad observada en los ratones CC- RIX infectadas con MA- EBOV y en casos clínicos en el brote actual. El modelo que se describe en este documento puede ser implementado rápidamente para identificar marcadores genéticos, realizar estudios muy detallados de patogénesis, y evaluar estrategias terapéuticas que tienen un amplio espectro de actividad antiviral contra todos los virus de Ébola Zaire, incluyendo el virus responsable del brote actual de África Occidental.

Notas y referencias

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RECONOCIMIENTOS

Este estudio fue apoyado en parte por premios U54 AI081680 , AI109761 U19 , U19 y AI100625 del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud , y por el Programa de Investigación Intramural del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas , Institutos Nacionales de Salud. Micro datos de la matriz han sido depositados en la Expresión Génica Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) (número de acceso GSE57214 ), y los datos brutos se pueden obtener en https://www.ccebola.org/project/Supplemental /begin.view. A.L.R. diseñado el estudio, realizado el análisis funcional de los micro datos de la matriz , y escribió el manuscrito, AO infecciones realizados, de los controles veterinarios, necropsias , fenotipo evaluado , las muestras recogidas y procesadas , y el virus se valora a partir de órganos mediante el ensayo de formación de foco, MTF, MTH, FPMV y R.S.B. sistemas establecidos para el diseño y la cría de CC- RIX poblaciones de ratones y su utilización para los estudios de la patogénesis del virus y contribuyeron a la tensión de selección y análisis de datos, RG realizado la normalización de datos de la micro matriz , la corrección por lotes, y análisis de expresión diferencial , SMK y J.M.W. preparación objetivo realizado y la hibridación de la micro matriz, RL coordinan atención veterinaria para los animales de experimentación, DPS realizado tinción histopatológica y analizado los datos de histopatología, FF, DS, y EH asistida con procedimientos de ratón en alta contención biológica, MJT y R.G. secuenciación realizada y posterior análisis de ARN viral, AF realizó el análisis funcional de los datos de micro matriz, PS ARN viral cuantificado por PCR cuantitativa, M.J.K. editado el manuscrito, H.F. y M.G.K. contribuido de manera significativa al diseño del estudio, proporcionado el espacio y la infraestructura para los experimentos y análisis , con la asistencia en el análisis de datos , y editado el manuscrito.

Afiliaciones de los autores

1 Departamento de Microbiología de la Universidad de Washington, Seattle, WA , EE.UU.
2 Departamento de Genética de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.
3 Montañas rocosas Rama Veterinaria, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud, Laboratorios Montaña Rocosas, Hamilton, MT, EE.UU.
Laboratorio de Virología, Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas de los Institutos Nacionales de Salud, Laboratorios Montaña Rocosas, Hamilton, MT, EE.UU.
Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, Carolina del Norte, EE.UU.