Sobre el coronavirus, último estudio.

La estructura cristalina de la proteasa principal del SARS-CoV-2 proporciona una base para el diseño de inhibidores mejorados de α-cetoamida

Linlin Zhang ¹, ², Daizong Lin ¹, ³, Xinyuanyuan Sun ¹, ², Ute Curth ⁴, Christian Drosten ⁵ , Lucie Sauerhering ⁶ , ⁷ , Stephan Becker ⁶ , ⁷ , Katharina Rox⁸ , ⁹ , Rolf Hilgenfeld¹ , ² , *

Science  20 Mar 2020: eabb3405 DOI: 10.1126 / science.abb3405

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Resumen

La pandemia de COVID-19 causada por el SARS-CoV-2 es una emergencia de salud global. Un objetivo farmacológico atractivo entre los coronavirus es la proteasa principal (M ^pro , 3CL ^pro), debido a su papel esencial en el procesamiento de las poliproteínas que se traducen del ARN viral. Divulgamos las estructuras de rayos X del SARS-CoV-2 M ^pro no ligado y su complejo con un inhibidor de α-cetoamida. Esto se derivó de un inhibidor previamente diseñado pero con el enlace amida P3-P2 incorporado en un anillo de piridona para mejorar la vida media del compuesto en plasma. Según la estructura, desarrollamos el compuesto principal en un potente inhibidor del SARS-CoV-2 M ^pro. La caracterización farmacocinética del inhibidor optimizado revela un pronunciado tropismo pulmonar y la idoneidad para la administración por vía inhalatoria.

En diciembre de 2019, un nuevo coronavirus causó un brote de enfermedad pulmonar en la ciudad de Wuhan, capital de la provincia de Hubei en China, y desde entonces se ha extendido a nivel mundial ( 1 , 2 ). El virus se ha denominado SARS-CoV-2 ( 3 ), porque el genoma de ARN es aproximadamente un 82% idéntico al coronavirus del SARS (SARS-CoV); ambos virus pertenecen al clado b del género Betacoronavirus ( 1 , 2) La enfermedad causada por el SARS-CoV-2 se llama COVID-19. Mientras que al comienzo del brote, los casos estaban relacionados con el mercado de mariscos y animales de Huanan en Wuhan, la transmisión eficiente de persona a persona condujo a un crecimiento exponencial en el número de casos. El 11 de marzo, la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró el brote como una pandemia. A partir del 15 de marzo, hay> 170,000 casos acumulados a nivel mundial, con una tasa de letalidad de ~ 3.7%.

Uno de los objetivos farmacológicos mejor caracterizados entre los coronavirus es la proteasa principal (M ^pro, también llamada 3CL ^pro) (4). Junto con la (s) proteasa (s) tipo papaína, esta enzima es esencial para procesar las poliproteínas que se traducen del ARN viral (5). El M^pro opera en no menos de 11 sitios de escisión en la poliproteína grande 1ab (replicasa 1ab, ~ 790 kDa); la secuencia de reconocimiento en la mayoría de los sitios es Leu-Gln ↓ (Ser, Ala, Gly) (↓ marca el sitio de escisión). Inhibir la actividad de esta enzima bloquearía la replicación viral. Como no se conocen proteasas humanas con una especificidad de escisión similar, es improbable que los inhibidores sean tóxicos.

Anteriormente, diseñamos y sintetizamos α-cetoamidas peptidomiméticas como inhibidores de amplio espectro de las principales proteasas de betacoronavirus y alfacoronavirus, así como las proteasas 3C de enterovirus (6). El mejor de estos compuestos (11r ; Fig. 1) mostró una CE ₅₀de 400 picomolar contra MERS-CoV en células Huh7, así como valores bajos de EC ₅₀ micromolar contra SARS-CoV y una gama completa de enterovirus en varias líneas celulares, aunque La actividad antiviral parecía depender en gran medida del tipo de célula utilizada en los experimentos (6). Para mejorar la vida media del compuesto en plasma, modificamos 11r ocultando el enlace amida P3 - P2 dentro de un anillo de piridona ( Fig. 1, círculos verdes), con la expectativa de que esto podría evitar que las proteasas celulares accedan a este enlace y lo rompan. Además, para aumentar la solubilidad del compuesto en plasma y reducir su unión a las proteínas plasmáticas, reemplazamos el resto cinnamoil hidrófobo por el grupo Boc algo menos hidrófobo ( Fig. 1, círculos rojos) para dar 13a (ver esquema S1 para síntesis)

Fig. 1 Estructuras químicas de los inhibidores de α-cetoamida 11r, 13a, 13b y 14b.

Los círculos de colores resaltan las modificaciones de un paso del desarrollo al siguiente (ver texto).

Para examinar si el anillo de piridona introducido es compatible con la estructura tridimensional del objetivo, determinamos la estructura cristalina, con una resolución de 1.75 Å, del M ^pro de SARS-CoV-2 (Fig. 2). La estructura tridimensional es muy similar a la del SARS-CoV M ^pro , como se esperaba de la identidad de secuencia del 96% (véase la figura S7); la desviación rms entre las dos estructuras de enzimas libres es de 0.53 Å para todas las posiciones Cα (comparación entre la estructura SARS-CoV-2 M ^pro y la SARS-CoV M ^pro , entrada PDB 2BX4 (7)). Los dominios similares a proteasas 3C y quimotripsina y picornavirus 3C (residuos 10-99 y 100-182, respectivamente) son barriles β antiparalelos de seis cadenas que albergan el sitio de unión al sustrato entre ellos. El dominio III (residuos 198-303), un cúmulo globular de cinco hélices, está involucrado en la regulación de la dimerización del M ^pro, principalmente a través de una interacción puente salino entre Glu ²⁹⁰ de un protómero y Arg ⁴ del otro (8). El dímero ajustado formado por SARS-CoV-2 M ^pro tiene una interfaz de contacto, predominantemente entre el dominio II de una molécula y el NH ₂ residuos-terminal ( “N-dedo”) de la molécula de B, de ~ 1394 Å ², con las dos moléculas orientadas perpendicularmente entre sí (Fig. 2). La dimerización de la enzima es necesaria para la actividad catalítica, porque el dedo N de cada uno de los dos protómeros interactúa con Glu ¹⁶⁶ del otro protómero y, por lo tanto, ayuda a formar la bolsa S1 del sitio de unión al sustrato (9). Para alcanzar este sitio de interacción, el dedo N se comprime entre los dominios II y III del monómero original y el dominio II del otro monómero. Curiosamente, en el SARS-CoV pero no en el dímero de SARS-CoV-2 M ^pro, hay una interacción polar entre los dos dominios III que implica un enlace de hidrógeno de 2.60 Å entre los grupos hidroxilo de cadena lateral del residuo Thr ²⁸⁵de cada protómero, y soportado por un contacto hidrófobo entre la cadena lateral de Ile ²⁸⁶ y Thr ²⁸⁵ Cγ2. En SARS-CoV-2, la treonina se reemplaza por alanina (indicada por la esfera negra en la Fig. 2), y la isoleucina por leucina (ver Fig. S7). Se ha demostrado previamente que la sustitución de Ser ²⁸⁴, Thr ²⁸⁵ e Ile ²⁸⁶ por residuos de alanina en SARS-CoV M ^pro conduce a una mejora de 3.6 veces de la actividad catalítica de la proteasa, concomitante con un empaquetamiento ligeramente más cercano de los dos dominios. III del dímero uno contra el otro (10) Esto fue acompañado por cambios en la dinámica de la enzima que transmiten el efecto de la mutación al centro catalítico. De hecho, el reemplazo de Thr ²⁸⁵ Ala observado en el SARS-CoV-2 M ^pro también permite que los dos dominios III se acerquen un poco más cerca (la distancia entre los átomos de Cα de los residuos 285 en las moléculas A y B es de 6.77 Å en el SARS -CoV M ^pro y 5.21 Å en SARS-CoV-2 M ^pro y la distancia entre los centros de masa de los dos dominios III se reduce de 33.4 Å a 32.1 Å). Sin embargo, la eficiencia catalítica del SARS-CoV-2 M ^pro es solo un poco más alta, en todo caso ( k _cat / K _m = 3426.1 ± 416.9 s ⁻¹ M⁻¹) que el del SARS-CoV M ^pro ( k _cat / K _m = 3011.3 ± 294.6 s ⁻¹ M ⁻¹ ). Además, el estimado K _d de la disociación del dímero es el mismo (~ 2,5 M) para las dos enzimas, tal como se determina por ultracentrifugación analítica (fig. S8).

Fig. 2 Estructura tridimensional del SARS-CoV-2 M ^pro, en dos vistas diferentes.

Un protómero del dímero se muestra en azul claro, el otro en naranja. Los dominios están etiquetados por números romanos. Los residuos de aminoácidos del sitio catalítico se indican como esferas amarillas y azules, para Cys ¹⁴⁵ y His ⁴¹, respectivamente. (Un asterisco marca un residuo del protómero B (naranja)). Las esferas negras indican las posiciones de Ala ²⁸⁵ de cada uno de los dos dominios III (ver texto). Los términos de la cadena están etiquetados como N y C para la molécula A (azul claro) y N * y C * para la molécula B (naranja).

Utilizamos esta estructura cristalina para acoplar la α-cetoamida 13a; Esto sugirió que el anillo de piridona podría tener algún choque estérico con la cadena lateral de Gln189. Sin embargo, en nuestro trabajo anterior ( 6 ), encontramos que Gln189 era bastante flexible y, por lo tanto, seguimos adelante con 13a como líder. La vida media plasmática de este compuesto en ratones aumentó ~ 3 veces en comparación con 11r (de 0.3 horas a 1.0 horas), la solubilidad cinética plasmática in vitro mejoró en un factor de ~ 19 (de 6 μM por 11r a 112 μM para 13a) y la solubilidad termodinámica por un factor de ~ 13 (de 41 μM a 530 μM). La unión a la proteína plasmática del ratón se redujo del 99% al 97% (muchos fármacos tienen una unión a la proteína plasmática> 90%; (11). Sin embargo, en comparación con 11r (IC ₅₀ = 0.18 ± 0.02 μM), la modificación estructural condujo a cierta pérdida de actividad inhibitoria contra la proteasa principal de SARS-CoV-2 (IC ₅₀ = 2.39 ± 0.63 μM) así como las proteasas 3C (3C ^pro) de enterovirus. 11r fue diseñado para una actividad de amplio espectro, con el resto ciclohexilo P2 destinado a llenar un bolsillo en el enterovirus 3C ^pro. El bolsillo S2 del betacoronavirus M ^pro (ver Fig. 3) presenta una plasticidad sustancial que le permite adaptarse a la forma de restos inhibidores más pequeños ( 6 ). Para mejorar la actividad antiviral contra los betacoronavirus del clado b (SARS-CoV-2 y SARS-CoV), sacrificamos el objetivo de la actividad de amplio espectro y reemplazamos el resto ciclohexilo P2 de 13a por el ciclopropilo más pequeño en 13b ( Fig. 1, círculos azules). Aquí presentamos estructuras cristalinas de rayos X en dos formas cristalinas diferentes, a una resolución de 1.95 y 2.20 Å, del complejo entre la α-cetoamida 13b y el M ^pro de SARS-CoV-2 ( Fig. 3 ). Una estructura está en el grupo espacial C 2, donde ambos protómeros del M ^pro los dímeros están unidos por la simetría de cristal para tener conformaciones idénticas, el otro está en el grupo espacial P 2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ , donde los dos protómeros son independientes entre sí y libres para adoptar conformaciones diferentes. De hecho, encontramos que en la última estructura cristalina, el residuo clave Glu ¹⁶⁶ adopta una conformación inactiva en el protómero B (como lo demuestra su distancia de His ¹⁷² y la falta de interacción de unión H con el resto P1 del inhibidor), incluso aunque el compuesto 13b está unido en el mismo modo que en la molécula A. Este fenómeno también se ha observado con el SARS-CoV M ^pro (12)) y es consistente con la actividad de medio sitio descrita para esta enzima (13). En todas las copias del SARS-CoV-2 M ^proinhibido, el inhibidor se une al sitio de unión de sustrato poco profundo en la superficie de cada protómero, entre los dominios I y II ( Fig. 3).

 

Fig. 3 Compuesto 13b en la hendidura de unión al sustrato ubicada entre los dominios I y II del M ^pro , en forma de cristal monoclínico (grupo espacial C 2).

Se muestra la densidad F _o -F _c para el inhibidor (nivel de contorno: 3σ). Los átomos de carbono del inhibidor son magenta, excepto en el anillo de piridona, que es negro; los átomos de oxígeno son rojos, azul de nitrógenos y amarillo de azufre. Los símbolos azul claro S1, S2, S3, S4 indican los bolsillos de unión canónica para los restos P1, P2, P3, P4 (símbolos rojos) del inhibidor peptidomimético. Los enlaces de hidrógeno se indican con líneas rojas discontinuas. Tenga en cuenta la interacción entre el residuo N-terminal de la cadena B, Ser ¹ * y Glu ¹⁶⁶de la cadena A, que es esencial para mantener el bolsillo S1 en la forma correcta y la enzima en la conformación activa. Recuadro: tiohemiketal formado por el ataque nucleofílico de la cisteína catalítica sobre el carbono α del inhibidor en su F_o -F _c densidad (contorneada a 3σ). La estereoquímica de la α-carbono es S . Ver fig. S8 para más detalles.

A través del ataque nucleófilo del catalizador Cys ¹⁴⁵ sobre el grupo α-ceto del inhibidor, se forma un tiohemiketal en una reacción reversible. Esto se refleja claramente en la densidad de electrones ( Fig. 3 recuadro); La estereoquímica de este resto quiral es S en todas las copias del compuesto 13b en estas estructuras. El grupo oxianión (o hidroxilo) de este tiohemiketal está estabilizado por un enlace de hidrógeno de His ⁴¹ , mientras que el oxígeno amida de 13b acepta un enlace de hidrógeno de las amidas de la cadena principal de Gly ¹⁴³ , Cys ¹⁴⁵ y en parte Ser ¹⁴⁴, que forman el "agujero de oxianión" canónico de la cisteína proteasa. Es una ventaja de las α-cetoamidas que su ojiva puede interactuar con el centro catalítico de las proteasas objetivo a través de dos interacciones de enlace de hidrógeno ( 6 ), en lugar de solo una como con otras ojivas como los aldehídos ( 14 ) o los aceptores de Michael ( 15). ).

El resto P1 γ-lactama, diseñado como un sustituto de glutamina ( 15 , 16 ), está profundamente incrustado en el bolsillo S1 de la proteasa, donde el nitrógeno de la lactama dona un enlace de hidrógeno de tres centros (bifurcado) al oxígeno de la cadena principal de Phe ¹⁴⁰ (3.20 / 3.10 / 3.28 Å; valores para la estructura en el grupo espacial C 2 / grupo espacial P 2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ molécula A / grupo espacial P 2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ molécula B) y para el carboxilato Glu ¹⁶⁶ (3.35 / 3.33 / (3.55) Å), y el oxígeno carbonílico acepta un enlace H 2.57 / 2.51 / 2.81-Å del imidazol de His ¹⁶³. Los P2 ciclopropilo ajustes de restos metilo perfectamente en el subsitio S2, que se ha reducido en 28 Å ³en comparación con el complejo entre el compuesto 13a con P2 = ciclohexilo metilo y el SARS-CoV M ^pro ( 17 ). La piridona en la posición P3 - P2 del inhibidor ocupa el espacio normalmente ocupado por la cadena principal del sustrato, su oxígeno carbonílico acepta un enlace de hidrógeno 2.89 / 2.99 / 3.00-Å de la amida de la cadena principal del residuo Glu ¹⁶⁶. Además, la amida P3 dona un enlace H 2.83 / 2.96 / 2.87-Å al oxígeno de la cadena principal de Glu ¹⁶⁶. Incrustado dentro de la piridona, el nitrógeno P2 ya no puede donar un enlace de hidrógeno a la proteína (el enlace H impedido de formar conectaría el nitrógeno P2 y el oxígeno de la cadena lateral de Gln189; estos dos átomos se destacan en la figura S8) . Sin embargo, nuestras estructuras cristalinas anteriores mostraron que la amida de cadena principal P2 de las α-cetoamidas lineales no forma un enlace de hidrógeno con la proteína en todos los casos, por lo que esta interacción no parece ser crítica ( 6 ). El grupo protector Boc en P3 no ocupa el sitio canónico S4 de la proteasa (en contraste con los grupos protectores de otros inhibidores en complejo con el SARS-CoV M ^pro (18), pero está ubicado cerca de Pro ¹⁶⁸ (3.81 / 4.17 / 3.65 Å; Fig.3); Debido a esta interacción, el último residuo se mueve hacia afuera en más de 2 Å (en comparación con la estructura de la enzima libre). Este contacto explica por qué eliminar el grupo Boc como en el compuesto 14b ( Fig. 1, círculos morados) debilita la potencia inhibitoria de este compuesto por un factor de aproximadamente 2. Curiosamente, hay un espacio entre el anillo de piridona de 13b, la cadena principal del residuo Thr ¹⁹⁰, y la cadena lateral de Gln ¹⁸⁹ (distancia más pequeña: 3.6 Å) que se llena con una molécula DMSO en la estructura cristalina C 2 y una molécula de agua en el P 2 ₁ 2 ₁ 2 ₁estructura. Esto sugiere que los restos P3 más voluminosos que la piridona pueden aceptarse aquí.

El compuesto 13b inhibe el SARS-CoV-2 M ^pro recombinante purificado con IC ₅₀ = 0,67 ± 0,18 μM. Los valores de IC ₅₀ correspondientes para la inhibición del SARS-CoV M ^pro y el MERS-CoV M ^proson 0.90 ± 0.29 μM y 0.58 ± 0.22 μM, respectivamente. En un replicón de SARS-CoV ( 19 ), la replicación de ARN se inhibe con CE ₅₀ = 1.75 ± 0.25 μM. En las células Calu3 humanas infectadas con el nuevo coronavirus, SARS-CoV-2, se observa una CE ₅₀ de 4 - 5 μM, mientras que el compuesto 14b que carece del grupo Boc está casi inactivo ( Fig. 4) Esto sugiere que el grupo Boc hidrofóbico y voluminoso es necesario para cruzar la membrana celular y que un resto aún más hidrofóbico podría ser ventajoso aquí, aunque esto puede conducir nuevamente a una mayor unión a proteínas plasmáticas como se observa para el 11r que contiene cinamoilo.

Fig. 4 El compuesto 13b inhibe la replicación del SARS-CoV-2 en células pulmonares Calu3 humanas.

(A) Las células Calu-3 se infectaron con SARS-CoV-2 usando un MOI de 0.05 y se estimularon con DMSO (barra negra) o diferentes cantidades (5, 10, 20 o 40 μM) de 13b (barras azules) o 14b (barras naranjas) y analizadas a las 24 horas pi. En (A), se aisló el ARN total de los lisados ​​celulares y se analizó el contenido de ARN viral mediante qPCR. (B) Para la estimación del valor de CE ₅₀ del compuesto 13bfrente al SARS-CoV-2, se preparó una curva dosis-respuesta (GraphPad). (A) representa las medias ± DE de dos experimentos biológicos con dos réplicas técnicas cada uno.

Para evaluar las propiedades de absorción - distribución - metabolismo - excreción (ADME) de las α-cetoamidas que contienen piridona, primero investigamos el compuesto 13a. La estabilidad metabólica en microsomas humanos y de ratón fue buena, con tasas de aclaramiento intrínsecas Cl _{int_mouse} = 32.0 μL / min / mg de proteína y Cl _{int_human} = 21.0 μL / min / mg de proteína. Esto significa que después de 30 minutos, alrededor del 80% para ratones y 60% para humanos, respectivamente, del compuesto residual se mantuvo metabólicamente estable. Los estudios farmacocinéticos en ratones CD-1 que utilizan la ruta subcutánea a 20 mg / kg mostraron que 13ª permaneció en el plasma durante solo 4 horas, pero se excretó a través de la orina durante hasta 24 horas. La C _max se determinó a 334,5 ng / ml y el tiempo medio de residencia fue de aproximadamente 1,6 horas. Aunque 13a parecía eliminarse muy rápidamente del plasma, se encontró a las 24 horas a 135 ng / g de tejido en el pulmón y a 52,7 ng / ml en fluido de lavado broncoalveolar (BALF), lo que sugiere que se distribuyó principalmente al tejido. A continuación, investigamos 13b por sus propiedades farmacocinéticas en ratones CD-1 utilizando también la ruta subcutánea, pero a 3 mg / kg. Los parámetros ADME de 13b fueron similares a 13a; Además, se encontró que la unión a las proteínas plasmáticas humanas era del 90%. La C _max de 13b se determinó a 126,2 ng / ml. Esto es alrededor del 37% de la C _max detectada para 13a, aunque la dosis de 13b fue aproximadamente 7 veces menor. El tiempo medio de residencia para 13b se extendió a 2,7 horas y la vida media plasmática en ratones fue de 1,8 horas. Además, 13b mostró un aclaramiento menos rápido en comparación con 13a (tabla S3). Durante el estudio farmacocinético con 13b, monitoreamos sus niveles de tejido pulmonar. Después de 4 horas, todavía se encontraron alrededor de 13 ng / g de 13b en el tejido pulmonar. Este tropismo pulmonar de 13a y 13b es beneficioso dado que COVID-19 afecta los pulmones. Además de la administración subcutánea, 13b se nebulizó usando un dispositivo de inhalación a 3 mg / kg. Después de 24 horas, 33 ng / g 13b fueron encontrados en el tejido pulmonar. La inhalación fue bien tolerada y los ratones no mostraron ningún efecto adverso, lo que sugiere que de esta manera, sería posible la administración directa del compuesto a los pulmones. Dados estos resultados farmacocinéticos favorables, nuestro estudio proporciona un marco útil para el desarrollo de los inhibidores que contienen piridona hacia los fármacos anticoronavirales.

Referencias y notas

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Agradecimientos: Los autores agradecen a Yuri Kusov y Guido Hansen, así como a Aws Aljnabi por determinar las actividades inhibidoras de los compuestos en un replicón SARS-CoV y contra MERS-CoV M ^pro recombinante , respectivamente, y a Thorsten Biet por registrar ¹³ C NMR espectros Agradecemos a Andrea Ahlers, Janine Schreiber y Lidia Litz por su excelente asistencia técnica, Kuilan Chen por su continuo apoyo organizativo y al personal de la línea de luz 14.2 de BESSY II, Berlín, Alemania, por su ayuda con la recopilación de datos de difracción. Financiación: Agradecemos al Centro Alemán de Investigación de Infecciones (DZIF) por su apoyo financiero (proyectos TTU01, subvención # 8011801806, y TTU09, subvención # 8004709710). Contribuciones de autor: Conceptualización: LLZ, DZL, RH; Investigación: LLZ, DZL, XYYS, UC, LS, SB, KR, RH; Contribución de materiales de investigación: CD; Redacción - preparación del borrador original: RH, DZL, KR; Redacción - revisión y edición: LLZ, DZL, UC, LS, KR, RH; Visualización: LLZ, LS; Supervisión: RH; Adquisición de fondos: RH, SB, KR; Conflicto de intereses: la Universidad de Lübeck ha presentado una solicitud de patente que cubre los compuestos 13a y 13b , así como los compuestos relacionados con una estructura de piridona en la posición P3 - P2, con LLZ, DZL y RH como inventores. Disponibilidad de datos y materiales: las coordenadas cristalográficas y los factores de estructura están disponibles en el PDB con los códigos de acceso 6Y2E (M ^{pro sin} control), 6Y2F (complejo con13b en el grupo espacial C 2) y 6Y2G (complejo con 13b en el grupo espacial P 2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ ). El plásmido que codifica el SARS-CoV-2 M ^pro estará disponible gratuitamente. Las cantidades disponibles de inhibidores son limitadas.